EFFETTI DI UN AMBIENTE A BASSE DOSI DI RADIAZIONI COSMICHE SULLA BIOLOGIA DI MICROINVERTEBRATI
Introduzione
I raggi cosmici rappresentano un fattore permanentemente presente nell'evoluzione biologica e nell'invecchiamento cellulare ( 1 ). Pertanto, nel corso della selezione naturale, gli organismi viventi hanno sviluppato meccanismi di difesa biologici/biochimici contro i danni causati dalle radiazioni presenti nell'atmosfera terrestre.
Da studi fatti nello spazio, dove le radiazioni cosmiche sono superiori a quelle presenti sulla superficie terrestre, si sono potuti delineare i principali bersagli cellulari e le possibili conseguenze causate dalle radiazioni cosmiche. Gli esperimenti fatti nello spazio hanno evidenziato: rottura del DNA in diversi punti della doppia elica, mutazioni ( 2-4 ), perossidazione lipidica ( 5 ), secrezione citochinica ( 6 ), ma anche inibizione di proliferazione, del differenziamento cellulare, e delle interazioni cellula-cellula, nonché riduzione dell'attività citotossica mediata dal sistema immunitario ( 2,6 ). E' stato inoltre osservato che i raggi cosmici inducono l'espressione di p53, una proteina che, causando apoptosi o bloccando la transizione G1/S del ciclo cellulare, salvaguarda la stabilità del genoma e quindi protegge dalla formazione di tumori indotti da agenti chimici e fisici ( 2,3,7 ).
E' interessante il fatto che diversi organismi e cellule precedentemente esposti a basse dosi di radiazioni od a mutageni chimici possono diventare resistenti a successive esposizioni a radiazioni (capacità di adattativa) ( 8 ). Questa capacità adattativa di cellule indotta dall'esposizione a raggi cosmici è stata recentemente studiata presso i Laboratori Nazionali del Gran Sasso (LNGS). I LNGS sono provvisti di un laboratorio sotterraneo che offre l'opportunità di valutare gli effetti di un ambiente a bassa radioattività sugli organismi viventi. Gli esperimenti biologici eseguiti nei LNGS (progetti Pulex e Pulex-2) su cellule di lievito (9) e su fibroblasti di criceto ( 10 ) suggeriscono che le radiazioni di fondo giocano un ruolo importante nel determinare una serie di processi adattativi cellulari, ed in particolare che cellule cresciute a basse dosi di radiazioni: 1) sono meno protette da danni al DNA indotti da agenti chimici e fisici; 2) presentano una maggiore sensibilità (predisposizione?) all'apoptosi; 3) presentano una diversa capacità a far fronte ad agenti ossidanti.
In generale i raggi cosmici influenzano da un lato l'invecchiamento cellulare e dall'altro favoriscono l'induzione di sistemi enzimatici capaci di proteggere le cellule dai danni prodotti dalle radiazioni stesse. E' plausibile che mentre le radiazioni cosmiche inducono su cellule in coltura meccanismi di difesa contro le radiazioni stesse e contro altri agenti mutageni, l'ambiente a bassa radiazione di fondo del laboratorio sotterraneo del Gran Sasso non abbia effetti negativi sui sistemi enzimatici di cellule criopreservate.
Alla luce delle conoscenze acquisite sugli effetti biologici di un basso dosaggio di raggi cosmici sull'attività di cellule isolate ( 9,10 ), si intende inoltre effettuare uno studio dei medesimi effetti su animali, in quanto organismi complessi ed a vita autonoma.
Tra i numerosi taxa animali che potenzialmente potrebbero costituire significativi modelli di indagine, due gruppi di microinvertebrati acquatici, Rotiferi e Gastrotrichi, sembrano idonei allo scopo per le loro caratteristiche biologiche ed ecologiche ( 11,12 ). Si tratta di organismi totalmente o parzialmente eutelici (in cui cioè le cellule non si riproducono più dopo la nascita), a ciclo vitale relativamente breve (compreso nell'ambito di settimane), e capaci di produrre forme di resistenza (dormienza) ( 13 ). Queste ultime, in particolare, sono note per presentare una accresciuta resistenza rispetto alle forme attive nei confronti di eventuali stress ambientali ( 14 ). Fasi di dormienza sono facilmente inducibili sperimentalmente sottraendo acqua, perchè questi animali sono naturalmente capaci di resistere al disseccamento del loro ambiente ( 15, 19, 20 ). I rotiferi bdelloidei sono capaci di anidrobiosi (= vita senz'acqua) in qualsiasi fase del ciclo vitale, disidratandosi e permanendo dormienti, ma vitali, fino a successiva reidratazione. Tale processo non sembra avere costi sul ciclo vitale, se non in termini di mortalità per condizioni non opportune durante la disidratazione, oppure per lunga durata della dormienza, o per incidenti durante la dormienza. Per contro l'anidrobiosi ha l'effetto di bloccare del tutto i processi di invecchiamento, e mantenere l'età del rotifero ferma al momento della disidratazione ( 15, 16 ). Si intende condurre una serie di test in condizioni protette da radiazioni, quali quelle garantite da un laboratorio sotterraneo, da confrontare con i risultati di analoghi test condotti in un laboratorio esterno; gli esperimenti interesseranno 1) stadi embrionali, 2) forme attive e forme di resistenza.
Le valutazioni sui microinvertebrati verranno svolte presso il Centro di Analisi Strutturali Avanzate (C.A.S.A.) e presso il Laboratorio di Zoologia dell'Istituto di Scienze Morfologiche dell'Università di Urbino, e presso il Dipartimento di Biologia, sezione di Zoologia Scienze Naturali dell'Università Statale di Milano, i cui ricercatori da anni si occupano di aspetti sperimentali della biologia di microinvertebrati acquatici (vedi pubblicazioni
11,12,15,16, 17,18, 19,20 in elenco).
Scopo della Ricerca
Il principale scopo di questa ricerca è di valutare l'influenza di basse dosi di radiazioni cosmiche ambientali sulla biologia di microinvertebrati, ed in particolare sulla fase di sviluppo embrionale e sulla capacità di riattivazione delle forme di resistenza. La ricerca proposta si affianca al parallelo progetto CRIO-STEM relativo alla valutazione dopo scongelamento della vitalità ed integrità delle cellule criopreservate in presenza di radiazioni di fondo normali o ridotte,
Materiali e metodi
I campioni sperimentali saranno prelevati da allevamenti tenuti in condizioni di laboratorio.
1) Test su stadi embrionali.
Singole uova appena deposte e non ancora segmentate verranno immediatamente isolate, trasferite nel laboratorio sotterraneo, e mantenute in condizioni di temperatura controllata (22 °C) per l'intera durata dello sviluppo embrionale, pari a circa quattro giorni per il rotifero ( Macrotrachela quadricornifera ) e due giorni per i gastrotrichi nelle condizioni stabilite. Una volta ultimato lo sviluppo, una parte degli individui verranno allevati nel laboratorio esterno per il rilevamento dei parametri del ciclo vitale (fertilità, sopravvivenza, tassi di riproduzione età-specifici, etc), e il rimanente verrà trattato per l'analisi della morfologia fine (T.E.M. e S.E.M.), secondo gli specifici protocolli di preparazione già utilizzati in ricerche morfologiche parallele (16 bis, 31,32 ). Come controllo, prove parallele verranno condotte su campioni di uova non ancora segmentate mantenute nel laboratorio esterno.
2) Test su forme di resistenza
Per quanto riguarda lo studio delle forme di resistenza e della loro riattivazione dopo reidratazione, verranno mantenute nel laboratorio sotterraneo forme dormienti che alla scadenza di periodi di 30 giorni saranno riattivate, registrandone la vitalità. Anche in questo caso, come controllo, verranno condotte prove parallele su campioni del tutto simili, mantenuti nel laboratorio esterno nelle stesse condizioni ambientali. Oltre alla percentuale di ripresa vitale dopo la fase di dormienza, sarà inoltre presa in esame al S.E.M. ed al T.E.M. la morfologia degli animali sia all'inizio che alla fine del medesimo periodo.
Il progetto prevede due fasi,:
1. Sviluppo embrionale . La durata è valutabile in termini di pochi giorni, durante i quali si svolge l'intero processo. La fase successiva di studio sia della morfologia sia dell'autoecologia degli animali non comporta l'utilizzo del laboratorio sotterraneo.
2. Stadi di resistenza . L'induzione della forma anidrobionte (di resistenza) avverrà in condizioni controllate, e poiché richiede l'impiego di strumenti ad hoc (termo-umidostato) verrà condotta nel laboratorio esterno. Il laboratorio sotterraneo servirà per il mantenimento dei campioni dormienti, i quali, mensilmente, verranno prelevati, riattivati e sottoposti alle analisi indicate.
Personale ed attrezzature necessarie
La previsione di impegno di personale adeguatamente addestrato alle tecniche di coltura e di osservazione di microinvertebrati è la seguente:
2 unità (1 per Rotiferi, 1 per Gastrotrichi), per la durata di 1-3 giorni per esperimento, per il controllo dello sviluppo embrionale degli individui isolati e dello stato vitale delle forme di resistenza. I campioni in dormienza dovranno solo essere trasportati all'interno od all'esterno del laboratorio sotterraneo, nel quale non sarà quindi necessario un lavoro continuativo; la maggior parte dell'attività di controllo ed osservazione potrà svolgersi pertanto nel laboratorio esterno o presso il C.A.S.A., il Laboratorio di Zoologia dell'Università di Urbino e il Dipartimento di Biologia dell'Università di Milano.
Le attrezzature indispensabili alla realizzazione di questa seconda parte del progetto sono:
• uno stereomicroscopio a luce sia trasmessa sia incidente a fibre ottiche, con obiettivo a zoom fino ad almeno a 40x (Fig. 1);.
• un microscopio ottico con set minimo di obiettivi 10x, 25x, 40x, 100x ad immersione in campo chiaro, meglio se a contrasto di fase oppure interferenziale (Nomarski), e possibilmente predisposto all'inserimento di macchina fotografica, o telecamera (Fig.2);
• una cella termostatica o incubatore con temperatura costante (20-25 °C) e controllo del tasso di umidità (Fig. 3);
• vetreria varia, in particolare pipette Pasteur, tubo di vetro per micropipette, scatole Petri (Ø 3 cm, 6 cm, 12 cm), vetrini portaoggetti 26 x 72 mm, coprioggetti 15 x 15 mm e 18 x 18 mm, aghi manicati, capsule Boveri Ø 2-3 mm;
• fissativi per studio S.E.M. e T.E.M.;
• fluorocromi per studio microscopico in fluorescenza.
Presso il C.A.S.A. ed il Laboratorio di Zoologia dell'Università di Urbino sono disponibili per lo svolgimento delle osservazioni relative a questa ricerca le seguenti attrezzature:
• microscopio ottico a fluorescenza;
• microscopio ottico a contrasto interferenziale con sistema fotografico digitale;
• microscopio elettronico a scansione (S.E.M.);
• microscopio elettronici a trasmissione (T.E.M.).
Presso il Dipartimento di Biologia dell'Università di Milano sono disponibili le seguenti attrezzature per svolgere questa ricerca:
• microscopio ottico a contrasto di fase e interferenziale con sistema fotografico digitale;
• microscopio stereoscopico con campo scuro;
• microscopio elettronico a scansione (S.E.M.);
• microscopio elettronici a trasmissione (T.E.M.).
• cella termo-umidostatica per indurre l'anidrobiosi in condizioni controllate;
cella termostatica per condurre allevamenti in condizioni controllate.
Fig.1 – Stereomicroscopio a luce trasmessa
Fig.2
- Microscopio ottico a contrasto interferenziale
Fig.3 – Allevamenti di microinvertebrati in cella termostatica
